血清清、球蛋白分离(新).ppt

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内容
实验目的
1
实验原理
2
实验材料
3
实验过程
4
5
注意事项
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实验目的
掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法
掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法
掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法
掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法
了解柱层析技术
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实验分组
四个人一小组
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实验过程
盐析(粗分离)
葡聚糖凝胶层析(脱盐)
DEAE纤维素离子交换层析(纯化)
醋酸纤维素薄膜电泳(纯度鉴定)
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实验材料
人混合血清
葡聚糖凝胶(G-25)层析柱
DEAE纤维离子交换层析柱
饱和硫酸铵溶液
醋酸铵缓冲溶液
20%磺基水杨酸
1%BaCl2溶液
氨基黑染色液
漂洗液

电泳仪、电泳槽
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实验原理
蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别,可分离纯化各种蛋白质。
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蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法
蛋白质的理化性质
常用的纯化方法
分子质量
透析、超滤
凝胶层析★
离心
溶解度
调整pH
调整离子强度★
降低介电常数
电荷
电泳★
等电聚焦
离子交换层析★
特异结合部位
亲和层析
其他性质
吸附层析
液相层析
气相层析
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球蛋白
1
2


等电点




~
相对分子量(×104)

20
30
9~15
~30
含量(%)
57~67
2~5
4~9
~12
12~20
血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量
清蛋白A
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(盐析法)
由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样。
调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。
血清清蛋白
球蛋白
半饱和硫酸铵
清蛋白不沉淀,上清
球蛋白沉淀,蒸馏水溶解
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盐析法
盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度或达饱和状态,可使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。
水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间聚集而沉淀。
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